古朵教您如何解决免疫荧光染色背景色?

免疫荧光染色是一种常用的一种生物化学检查方法，常用于组织学中抗原或抗体的定位，也可用于体液标本中抗原或抗体的定量检测。许多小伙伴，在做免疫荧光染色实验时，碰到各种各样的问题。事实上，掌握了免疫荧光染色实验的原理、操作步骤及注意事项，要成功完成一项免疫荧光染色实验并不难。

1、免疫荧光技术是什么?

免疫荧光技术( )又称荧光抗体技术，主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。免疫荧光技术既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强。

免疫荧光染色实验有两种，包括直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。

免疫荧光法原理图

直接免疫荧光法是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。

间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。

两种方法，基本原理是一样的。免疫荧光 (IF) 或细胞成像技术使用抗体将荧光染料(也称为荧光素或荧光物)标记到特异性目标抗原上，所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素 (FITC) 等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于IF实验中。

直接免疫荧光法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想。

间接免疫荧光法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。所以间接免疫荧光法更加常用，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。

细胞爬片的免疫荧光

1)取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的培养皿里，PBS洗三遍。

有的时候作的细胞爬片可能比较小，夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2) 4%冷的多ju甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3)0.2% X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4) 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5)一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6)二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7)最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8)蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

免疫荧光染色操作注意事项

1)荧光试剂要放好

尽管许多荧光基团具有相对的光稳定性，但在保存和染色过程中若未能避光，则可能导致荧光基团-抗体结合物降解，引起假阴性结果。因此，荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。

2)选择荧光要谨慎

免疫荧光技术的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，如今流式细胞仪能检测每个细胞中20多个离散参数。在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的独特性质，如最大吸收波长和最大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素。

3)合适对照不可少

任何实验数据的分析都依赖于相关的对照，免疫荧光染色也不例外。每次试验时 ，需设置以下三种对照：

(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物

(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物

(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

5、免疫荧光实验常见问题排除指南

1)背景染色太强

背景染色太强是指除了我们想看到的特异性染色在前台唱主角演戏，还有一堆吃瓜群众(与想看到的特异性染色颜色相同)在后面抢戏。

是什么原因导致这些戏精抢了主角的戏呢?可能的原因如下。

组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。

封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间

二抗有非特异性结合：要想验证是否如此，可以在染色过程中做个只加二抗的空白对照(也就是说不用特异性的一抗进行一抗的孵育过程，比如用一抗稀释液进行孵育一抗的步骤). 如果空白对照有染色，说明二抗有非特异性结合，这时候建议更换一种二抗。

自体荧光:想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊2醛固定，或者使用含0.1% 氢peng化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

抗体浓度太高：降低所使用的抗体浓度或调整孵育时间。

洗涤不充分:染色有很多步骤，其中又包括很多洗涤的步骤。在实验过程中，确保洗涤到位，不要偷工减料。

2)染色较弱或没有染色

可能的原因如下：组织本身不存在你想研究的目的蛋白或者表达量很少。

如果怀疑目的蛋白并不存在，可以通过多种方式验证，比如WB。因为不同探究蛋白的实验的原理和操作会不一样，所以可能得到的结果会不一样，多种实验的验证更有可能避免假阴性的出现。如果目的蛋白表达量很少，则可以考虑增加一个扩大荧光信号的步骤。

荧光显微镜的问题。

如果对荧光显微镜的参数设置不对，有可能导致看不到荧光。比如光源/滤光设备与你想检测的荧光不匹配。每次拍照，记得检查参数是否有误。

曝光时间太短或吸光太少(gain值太低):可以尝试调大Gain值并/或增加曝光时间，找到最佳值。

曝光时间太长，出现荧光淬灭：避免让切片过度曝光。使用完立即将切片保存在黑暗处。

细胞/组织固定过度：因为过度固定可以让抗原表位带上面具，使得抗体无法与抗原结合，这样当然就没啥荧光啦。所以可以尝试减少固定的时间，也可以尝试做抗原修复以显现抗原表位。

组织/细胞干透:确保整个染色过程中，切片都处于潮湿环境。

细胞没有通透，一抗进不去:举例来说，如果你想研究的目的蛋白在细胞里面，但是抗体因为没有金刚钻，不能进入细胞里与目的蛋白长相厮守，那么你当然看不到它们的爱情闪光点。所以呢，可以想办法让细胞开通绿色通道，搭个鹊桥。比如，如果使用甲醛固定组织细胞，可以用0.2% X-100(不同实验可能所需浓度不一)通透细胞。如果是用甲醇或者bin酮固定的组织细胞，则不需要使用 X-100，因为前者可以通透细胞。

一抗量不够/孵育时间太短:提高抗体的浓度或增加孵育时间

一抗不合适：购买一抗前，记得阅读产品信息，不是所有一抗都可以进行免疫荧光染色实验的。另外，确保产品没有过期。

一抗二抗不兼容：举例来说，如果你的组织来源是小鼠，那么一抗应该是某种动物抗小鼠，比如山羊抗小鼠，那么，此时二抗应该是某种动物抗山羊，比如兔抗山羊。也就是说，二抗应该是抗一抗宿主的。

切片储存时间过长：样品染色后应该尽快观察拍照，否则信号会随时间减弱。可以考虑将切片保存在 4⁰C 避光处，尽量延长储存时间。

抗体储存问题：避免反复冻融抗体，因为可能会引起抗体出现降解。建议买了抗体后，根据实验每次的需求，将抗体分成多个小份保存，这样每次使用一个小管即可。另外，储存前记得看说明书，根据说明书的指示进行保存。比如具体保存温度，是否要避光等。

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